N-亚硝胺类化合物是国际癌症研究机构认定的2A类致癌物[1]。这类物质能够直接损伤细胞DNA，诱发基因突变，进而促进肿瘤形成。由于其较强的毒性，ICH M7将之列为“关注阵列”物质[2]。在人用药品中，处方、工艺、包材、生产和贮藏环境等因素均可能导致N-亚硝胺类杂质的产生，原料药中出现N-亚硝胺类化合物与原料药自身制备过程，以及溶剂和设备中产生了直接或间接的交叉污染，还有在储存过程中发生了化学降解反应等可能原因有关。

　　N-亚硝胺类基因毒性杂质是近年来药品研发和注册审评过程中需要重点关注的问题。目前，国内外监管机构对于亚硝胺类杂质均建议采取 “避免为主，控制为辅”的策略。实施药品工艺开发时应遵循质量源于设计的理念，推荐采用ICHQ9《质量风险管理》中所述的失效模式与影响分析（FMEA）或失效模式、影响与关键性分析（FMECA）方法进行风险评估；如评估结果显示生产工艺有产生亚硝胺类杂质的风险，应尽量避免选择此类工艺，如果确实无法避免在同一品种生产过程中同时或先后使用亚硝化试剂和胺类，则应考虑优化反应条件降低亚硝胺类杂质生成的风险，并证明工艺对此类杂质有足够的清除能力，制定合理的控制策略。

　　根据化学结构是否与原料药有关，美国FDA指南将N-亚硝胺类杂质分为两种：小分子N-亚硝胺和NDSRI（与原料药化学结构有关的N-亚硝胺类）（见下图1-3）[3]。美国FDA、欧洲EMA均发布了一系列的关于N-亚硝胺类基因毒性杂质控制策略的指导原则，并提供了一些药物中已验证过的检测方法，这些方法可以用于其它药物中N-亚硝胺类基因毒性杂质方法开发的参考[4]。中国药监局也推出了化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）[5]。

　　随着对于N-亚硝胺类化合物的认识不断深入，近年来国内外对于该类化合物的检测方法也有了大量的报道。早期阶段主要集中于小分子N-亚硝胺类杂质，如赵艳霞等（2021）介绍了食品药品中N-亚硝基二甲胺(NDMA)的检测方法，包括超临界流体色谱法（SFC）、离子色谱法（IC）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱法（LC-MS）、气相色谱法（GC）、气相色谱热能分析法（GC-TEA）、气相色谱-质谱法（GC-MS）和其它方法，如表面增强拉曼散射法（SERS）、分子印迹技术等新型检测方法[6]。Khaja Moinuddin Shaik等（2022）综述了沙坦类药物、雷尼替丁、尼扎替丁、二甲双胍中小分子N-亚硝胺杂质的检测方法，包括LC-MS/MS、GC-MS-HS和HPLC，并且介绍了一系列的样品前处理技术，如固相萃取、液液萃取和快速开火技术（rapid-fire），下表表1为推荐的液质ESI离子源MRM模式下不同小分子N-亚硝胺类杂质的母离子和子离子及锥孔电压和碰撞能量参数[7]。孔璇(2022)按方法分类整理了近年来国内外对药物中小分子N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测方法，包括HPLC、LCMS和GCMS等[8]。Wisut Wichitnithad 等 (2023)总结了药物中小分子N-亚硝胺类杂质和NDSRI杂质GC和LC分析方法的色谱条件和灵敏度信息，并且介绍了在样品制备和进样过程中人为产生的N-亚硝胺类杂质会导致其检测结果虚高的案例。表2总结了国外官方机构开发的药物中亚硝胺类杂质检测方法，表3是药物中亚硝胺类杂质GCMS检测方法的总结，表4是药物中亚硝胺类杂质LCMS检测方法的总结[9]。Krishna Moorthy Manchuri等(2024)更为详尽地总结了近年来药物包括API和制剂中N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测方法，除了常用的HPLC、UPLC、GCMS和LCMS外，还介绍了CEMS（毛细管电泳质谱联用）和SFC（超临界流体色谱）在这方面的应用，因表格过大，此处未详细引用，感兴趣的同行可参考原文[10]。该作者（2025）随后又综述了2024年以来新报道的这类杂质的分析方法[11]。

　　▲表1：推荐的液质ESI离子源MRM模式下不同小分子N-亚硝胺杂质的母离子和子离子及锥孔电压和碰撞能量参数

　　表2：国外官方机构开发的药物中亚硝胺类杂质检测方法

　　▲表3：药物中亚硝胺类杂质GCMS检测方法的总结

　　▲表4：药物中亚硝胺类杂质LCMS检测方法的总结

　　综合以上研究内容可得：

　　1. 对于小分子N-亚硝胺类化合物，常用的分析方法按照使用频率依次为：LCMS/MS>LCMS>GCMS/MS>LC-HRMS>GCMS>LC。直接进样GCMS（或MS/MS）法相对顶空进样GCMS（或MS/MS）法具有较高的灵敏度，但由于样品成分复杂，可能会干扰目标物分析，甚至损伤色谱柱，因此有时需要进行合适的样品前处理；比如液液萃取，有研究表明，二氯甲烷是良好的萃取试剂，可以从水溶液中萃取得到小分子N-亚硝胺类化合物，而一些水溶性较好的干扰杂质可以保留在水层从而降低干扰。对于低沸点N-亚硝胺杂质，顶空进样GCMS（MS/MS）法可有效避免高沸点样品成分对于目标杂质的干扰，延长色谱柱寿命，并且降低对质谱检测器的污染，是应用较为广泛的N-亚硝胺方法。一般情况下小分子N-亚硝胺极性较强，在液相色谱中不容易被供试品干扰。但由于小分子N-亚硝胺类化合物结构较为简单，难以电离，因此对于液质常需采用APCI源，流动相常采用甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱，同等浓度下灵敏度常优于GCMS。 采用LCMS（或MS/MS）法分析的另一优点，对于某些容易造成假阳性的GCMS结果，如雷尼替丁在高温加热下会生成高水平的NDMA，LCMS/MS可以用于佐证结果的准确性。另外，当样品中含有N,N-二甲基甲酰胺（DMF），其同位素峰会对NDMA检测产生假阳性干扰物，采用LC-HRMS，设置质量偏差为5 ppm时，可以实现DMF和NDMA的分离，进而消除检验过程中的假阳性干扰影响[12，13]。蔡虹等在检测厄贝沙坦中N-亚硝基二乙胺（NDEA）时发现，沙坦原料药样品中的微量常规杂质1-戊酰胺在ESI正离子模式下，其加合[M+H]++1的同位素峰m/z与NDEA[M+H]离子的m/z相同，并且与NDEA类似，前者的加合离子同位素峰在MRM模式下也能裂解1个乙烯中性分子，产生m/z75同位素离子，导致当选择m/z103作为母离子，m/z75为定量子离子时，1-戊酰胺会对NDEA的检测产生干扰，采用特征选择性更强的m/z47定量子离子，可以消除该干扰[14]。

　　2. 对于NDSRI，常用的分析方法按照使用频率依次为：LCMS/MS>LCMS >LC-HRMS>LC。这是因为这些杂质通常具有较大的分子量，沸点较高，所以不适用于GCMS分析。当杂质具有较强紫外吸收且基质干扰较小的情况下，有望开发常规的HPLC-UV方法，这样更便于QC部门的日常放行检测。NDSRI的限度较一般的基因毒性杂质更低，且亚硝基化会占用化合物的仲胺或叔胺位点，如果结构中不含有其它如氨基等极性基团，质谱上的离子响应会显著降低，对方法的灵敏度将造成挑战，建议筛选不同类型的电离方式（APCI或ESI）和检测模式（正离子或负离子）；其次，由于此类化合物和主成分结构很相似，物化性质也较为接近，故色谱分离是其较大的难点；再次，由于这些杂质的限度极低，往往需要配制较高的样品浓度来满足灵敏度要求，此时除了供试品本身，供试品携带的杂质也可能显著干扰目标物的测定。由于这些杂质结构未知，因此多数情况下需要采取盲筛的方式进行色谱条件优化，必要时还可以通过液液萃取或重结晶等前处理方式，以消除基质干扰。笔者曾开发过一个NDSRI方法，由于API严重干扰目标杂质质谱响应，我们先采用二氯甲烷和酸性溶液对样品进行萃取，取有机层在氮气下吹干，然后加入另一种合适的稀释剂来溶解目标杂质，过滤去除残留的API，同时采用内标法来减少样品因萃取体积波动对结果的影响，对该方法进行了验证，结果表明方法具有良好的准确度和精密度，方法回收率可以达到90%以上。

　　3. 采用上述方法时，需对检测方法进行确认，重点关注检测方法的专属性及灵敏度。对于不能直接测定或在检测条件下不稳定的亚硝胺，可考虑采用衍生化法进行测定。需要注意的是，开发检测方法时需重点关注其专属性，避免出现假阳性及假阴性检测结果。因此，在检测亚硝胺类杂质时，除了需要开发高灵敏度的检测方法外，实际操作过程中还需格外谨慎仔细地排除来自仪器、器具、试剂、水、基质、环境等甚至是待测样品本身引起的干扰。

　　九洲药业（603456）研发分析中心配备了适用于N-亚硝胺基因毒性杂质检测的LCMS/MS（Agilent 6460/6470/6475）和 GCMS/MS（Agilent 7000）等分析仪器，并组建了了专注于包括N-亚硝胺类化合物在内的基因毒性杂质质量研究的质谱分析团队。自2020年以来。已开展N-亚硝胺类杂质相关方法开发与验证工作，累计完成小分子N-亚硝胺及NDSRI杂质检测方法50余套，支持了多个项目的质量研究需求。