近日，德国格赖夫斯瓦尔德大学医学院Holger N. Lode教授及其团队在国际期刊Cancers上发表了重要的研究成果 “Affinity Affects the Functional Potency of Anti-GD2 Antibodies by Target-Mediated Drug Disposition”。本研究采用神经母细胞瘤三维球体模型，系统阐明了两种不同亲和力的GD2单抗——中等亲和力抗体达妥昔单抗β（DB）和高亲和力抗体那西妥单抗（NAXI）在抗肿瘤效应中的功能性差异及其分子机制。研究发现，在临床相关浓度范围内，DB表现出优于NAXI的抗体依赖的细胞毒性作用（ADCC），该差异可能与NAXI具有更强的靶点介导的药物处置（TMDD）效应相关，具体机制包括NAXI结合力更易受死亡肿瘤细胞和可溶性GD2（sGD2）的影响而降低，且更易被肿瘤细胞和免疫细胞内化降解。

　　研究背景

　　高危神经母细胞瘤是一种起源于交感神经系统的恶性肿瘤，靶向GD2的单克隆抗体（mAbs）被证实可有效治疗高危神经母细胞瘤，并显著提高患者的生存获益。目前全球已有三种抗GD2单抗获得批准并被应用于临床，包括达妥昔单抗、达妥昔单抗β（DB）和那西妥单抗（NAXI）。达妥昔单抗和DB具有相同的ch14.18蛋白序列，同属人/鼠嵌合抗体，但糖基化结构不同。NAXI则是由鼠源性3F8单抗改造而来的人源化抗GD2单抗。这三种药物同为人源IgG1亚型，其主要的区别在于对GD2抗原的结合能力不同，DB 表现为中等亲和力，NAXI表现高亲和力。

　　既往研究发现，高亲和力mAbs可能以二价形式与靶标结合，从而降低了每个抗原可用的抗体数量，而具有较快解离率的中等亲和力mAbs可能以单价形式与靶标结合，从而增加靶细胞上的Fc密度，发挥更强的免疫效应。此外，mAbs还可能受抗原沉降效应的影响，也称之为靶点介导的药物处置（TMDD）作用，即当mAbs与大量靶抗原强烈结合时，抗体-抗原复合物会在细胞内快速内化和降解，此时，高亲和力的mAbs可表现出非线性的药代动力学特征，尤其是低剂量时可在体循环中快速被清除。

　　当前尚无头对头直接比较DB和NAXI在高危神经母细胞瘤中临床疗效差异的研究，已报道的临床研究中因纳入的患者人群不同，使得现有研究数据也不具备可比性。为此，本研究构建了不同GD2表达水平下的神经母细胞瘤三维球体模型，评估DB和NAXI这两种抗体的抗体依赖的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC），以及其结合亲和力对疗效的影响及其与TMDD的关系。

　　研究设计

　　本研究建立6种不同GD2表达水平的神经母细胞瘤三维球体模型，以表达近红外荧光蛋白（iRFP-680）作为活细胞标志。采用长期活细胞成像法，基于DB和NAXI不同的抗体浓度条件，分别评估两者的ADCC和CDC效应，并通过流式细胞术检测抗体与抗原的结合活性。在TMDD机制探索方面，分析DB和NAXI与死亡肿瘤细胞、sGD2结合的特性，评估两者在肿瘤细胞及免疫细胞中内化的程度，并探索sGD2对两者ADCC效应的影响。

　　01

　　神经母细胞瘤三维球体模型的构建与活力测定

　　在标准细胞培养条件下（37℃，5%CO2），培养6种不同GD2表达水平的人神经母细胞瘤细胞，包括LAN-1、CHLA-20、COG-440、SHEP-2、SK-N-SH和COG-N-519细胞模型。通过慢病毒转导，使得细胞系稳定表达iRFP-680作为活细胞标志。随后，将3000个表达iRFP-680的肿瘤细胞加入384孔超低吸附球体微孔板，以150 g的离心力离心10 min后，在细胞培养条件下培养72 h，形成肿瘤球体模型。

　　使用活细胞分析系统，每8 h采集一次图像。肿瘤球体的细胞活力（%）定义为，各时间点的肿瘤球体模型荧光强度与基线（0小时）荧光强度的比值。以曲线下面积（AUC）量化抗肿瘤效果，计算公式为：AUC（%*h）=[（时间点1活力+时间点2活力）/2]×（时间点2-时间点1）。

　　02

　　ADCC和CDC效应下的活细胞活力测定

　　ADCC效应下的肿瘤球体模型活细胞活力测定：分别将75000个效应细胞（外周血单核细胞，PBMCs）或10-5~1 μg/ml浓度梯度（覆盖临床相关浓度）的DB/NAXI加入肿瘤球体模型，形成ADCC体系，培养168 h（7天），监测活细胞活力。其中，仅加入PBMCs的肿瘤球体模型（非抗体依赖的细胞毒性，AICC）为对照组。

　　CDC效应下的肿瘤球体模型活细胞活力测定：使用12.5%活性人血清替代PBMCs，作为补体来源，其余方法同ADCC效应下的活细胞活力测定。其中，仅加入12.5%活性人血清的肿瘤球体模型（非补体依赖的细胞毒性，CIC）为对照组。

　　钙黄绿素-AM测定法评估二维（2D）肿瘤模型的CDC效应：将2500个/孔的LAN-1和CHLA-20神经母细胞瘤细胞用钙黄绿素-AM染色，随后与0.01~1 μg/ml梯度浓度的DB/NAXI或12.5%热灭活人血清（阴性对照，CIC）孵育4 h。孵育结束后，通过测量上清液中的（即肿瘤细胞裂解后释放游离的）钙黄绿素荧光强度（激发波长495 nm，发射波长515 nm），来量化细胞毒性。

　　评估可溶性靶抗原对ADCC效应的影响：基于高危神经母细胞瘤患者中报告的sGD2浓度水平（中位数100 nM，最大值1000 nM），在ADCC体系中额外加入100 nM和1000 nM sGD2（模拟高危患者血浆水平），并以存活率曲线下面积（%*h）量化肿瘤细胞杀伤效果。

　　03

　　DB/NAXI与靶向非活性肿瘤细胞预孵育后的结合力评估

　　为了比较NAXI和DB的解离速率特征，本研究将这两种抗体（0.001~10 μg/ml）与GD2阳性的非活性肿瘤细胞（0.5×10-6/ml）在1000 μl反应体系中4℃孵育60 min，随后离心，取含有未结合抗体的上清液用于活细胞染色（0.5×10-6/ml，20 min，4℃，标记为样本1）。同时，取0.5×10-6/ml活细胞直接用于相同浓度梯度（0.001~10 μg/ml）的NAXI/DB染色（20 min，4℃，标记为样本2）。

　　染色完成后，用洗涤缓冲液清洗细胞，随后加入Alexa Fluor偶联二抗（抗人IgG1）4℃避光孵育20 min。再次洗涤后，将细胞重悬于洗涤缓冲液中，通过流式细胞术检测GD2的几何平均荧光强度（gMFI），以检测残余抗体与活细胞的结合情况。以仅加入二抗的肿瘤细胞和未染色细胞作为阴性对照。

　　荧光强度损失倍数的计算公式为：荧光强度损失倍数=活细胞直接染色gMFI（样本2）/非活性肿瘤细胞预孵育后的上清液染色gMFI（样本1）。

　　04

　　评估sGD2对DB/NAXI的结合活性影响

　　为评估NAXI和DB抗体在sGD2存在下的解离特征，本研究采用流式细胞术进行竞争性结合实验。首先将NAXI和DB抗体用洗涤缓冲液稀释至0.001~1 μg/ml浓度范围，同时将GD2用甲醇配制成10 nM、100 nM和1000 nM三个浓度梯度，分别模拟健康对照组、高危神经母细胞瘤的中位浓度和最大浓度水平。实验设置3组对照：仅含甲醇的抗体溶液（不含sGD2）、仅洗涤缓冲液，以及仅甲醇（不含抗体和sGD2）。将不同浓度的抗体与sGD2在1000 μl反应体系中室温预孵育30 min后，加入经洗涤缓冲液（300 g离心5 min）清洗的CHLA-20神经母细胞瘤细胞，4℃孵育20 min完成结合反应。离心去除上清后，用Alexa Fluor偶联二抗（抗人IgG1）4℃避光染色20 min。洗涤后重悬细胞进行流式细胞术分析，以仅二抗染色和未染色细胞作为阴性对照。

　　以gMFI作为量化DB/NAXI的结合强度的指标。荧光强度损失倍数的计算公式为：荧光强度损失倍数=无sGD2的活细胞直接染色gMFI/抗体与sGD2混合液染色细胞gMFI。

　　05

　　基于活细胞成像的DB/NAXI在神经母细胞瘤细胞中的内化特性检测

　　为检测肿瘤细胞中DB/NAXI的内化与结合亲和力及浓度的关系，本研究采用pH敏感的荧光染料pHrodo对DB和NAXI进行标记，随后通过活细胞成像技术检测抗体的内化程度。将10,000个肿瘤细胞或100,000个PBMCs接种于96孔板培养24 h，随后加入0.001~1 μg/ml浓度梯度的pHrodo标记的NAXI或DB，设1 μg/ml利妥昔单抗与未处理的肿瘤细胞作为对照组。采用活细胞分析系统每2小时采集图像，以监测抗体内化过程。

　　抗体的内化程度定义为各时间点荧光强度与基线（0小时）的比值，结果以红色荧光强度的AUC±标准误（SEM）的形式呈现。

　　06

　　基于流式细胞术评估免疫细胞对DB/NAXI内化作用的影响

　　为检测白细胞对抗体的内化作用的影响，取100 μl肝素抗凝新鲜全血与1 μg pHrodo标记的NAXI或DB抗体在细胞培养条件下孵育4 h。进行免疫染色时，每个样本先加入20 μl抗人FcR阻断剂，4℃预处理10 min，随后加入APC/Vio770标记的抗人CD45抗体和APC偶联的抗人CD64抗体。4℃避光孵育30 min后，用4 ml洗涤缓冲液清洗样本，300 g离心5 min弃上清。为去除红细胞，加入2 ml红细胞裂解液轻柔混匀，室温孵育10 min，再加2 ml洗涤缓冲液后300 g离心5 min去除上清。流式检测前将细胞沉淀重悬于500 μl洗涤缓冲液，并在上机前5 min加入0.1 μg/ml DAPI染料以排除死亡细胞干扰，最后进行流式细胞分析。

　　为研究白细胞的GD2表达特征，另取未加pHrodo标记抗体的全血样本，采用上述相同方法进行抗人CD45-APC/Vio770、抗人CD64-APC以及PE偶联的抗GD2抗体的染色分析。

　　研究结果

　　01

　　DB vs NAXI的ADCC效应比较

　　本研究成功构建了6种不同GD2表达水平的肿瘤球体模型（图1A），所有细胞均可稳定表达iRFP-680作为活细胞标志（图1B、C）。

　　图1 不同GD2表达水平的肿瘤球体模型的构建

　　注：A. 神经母细胞瘤球体模型的GD2表达谱（左）及gMFI（右）；B. 在PBMCs（每孔75,000个）存在条件下，不同浓度DB处理时肿瘤球体模型活力随时间变化的示例曲线（左）和荧光显微图像（右）；C. 肿瘤球体活力-时间曲线下面积计算方法的示例及可视化展示

　　通过为期7天的活细胞活力测定，研究发现，在所有浓度下，DB和NAXI对GD2低表达或不表达的神经母细胞瘤细胞模型（SHEP-2、SK-N-SH、COG-N-519）均未显示ADCC活性，表明GD2表达是抗体介导Fcγ受体激活的关键因素。

　　在GD2高表达的肿瘤细胞模型（LAN-1、CHLA-20和COG-440）中，DB和NAXI在0.01~1 μg/ml浓度范围内均具有免疫活性（图2A-C）。然而，在0.01~0.1 μg/ml范围内，DB对GD2高表达神经母细胞瘤球体（LAN-1、CHLA-20、COG-N-440）诱导的ADCC反应显著强于NAXI（图2A-C）。DB在1 μg/ml浓度下对CHLA-20细胞的抗肿瘤活性也优于NAXI。值得注意的是，DB在极低浓度（0.01 μg/ml）下仍保持活性，而NAXI在此浓度下与仅用PBMCs处理的对照肿瘤球体（不依赖抗体的细胞毒性，AICC）相比，未显示出显著的ADCC反应。这些数据表明，DB比NAXI具有更强的ADCC效应，即使在较低抗体浓度的情况下也仍具有活性。

　　图2 DB和NAXI的ADCC效应比较

　　注：A. LAN-1肿瘤细胞球体；B. CHLA-20肿瘤细胞球体；C. COG-440肿瘤细胞球体

　　02

　　DB vs NAXI的CDC效应比较

　　通过二维(2D)钙黄绿素-AM测定法评估DB和NAXI的CDC效应，结果显示，1 μg/ml时，可观察到DB和NAXI介导的CDC效应可将肿瘤细胞完全裂解，但在0.1 μg/ml和0.01 μg/ml时CDC活性显著降低（图3A和B）。与ADCC结果一致，仅DB在0.01 μg/ml时仍对CHLA-20细胞系具有CDC活性（图3B）。

　　最重要的是，在7天长时程测定实验中评估3D球体对CDC效应的敏感性时，LAN-1和CHLA-20肿瘤细胞模型对两种抗体介导的CDC完全抵抗（图3C和D）。以上数据表明CDC需要比ADCC更高的抗体浓度来实现肿瘤细胞裂解，并且肿瘤球体模型对CDC具有抵抗性，因此，ADCC可能是两种抗体发挥作用的主要机制。

　　图3 DB和NAXI介导的CDC在二维（A，B）和三维球体模型（C，D）中的比较

　　注：A. LAN-1肿瘤细胞，二维模型；B. CHLA-20肿瘤细胞，二维模型；C. LAN-1肿瘤细胞，三维模型；D. CHLA-20肿瘤细胞，三维模型

　　03

　　DB vs NAXI与抗原结合的亲和力比较

　　研究表明，由于结合价态差异，高亲和力抗体相较于中等亲和力抗体而言存在劣势。高亲和力单抗倾向于双价结合抗原，而中等亲和力单抗主要为单价结合，这可能导致高亲和力抗体的抗原覆盖度相对降低。为验证这一假设，本研究采用10倍浓度梯度（0.001~1 μg/ml）的DB（中等亲和力）或NAXI（高亲和力）处理高表达GD2的CHLA-20和LAN-1神经母细胞瘤细胞，通过人IgG1特异性二抗染色后进行流式细胞术分析。

　　结果表明，在所有浓度下，NAXI和DB对LAN-1和CHLA-20细胞的平均荧光强度相似，NAXI在较高浓度下的信号略高，但无统计学意义，表明两者与肿瘤细胞的结合活性相当，抗原覆盖率模型可能不适用于评估两者的疗效差异（图4）。

　　图4 DB和NAXI与LAN-1和CHLA-20神经母细胞瘤的结合情况比较

　　注：A. LAN-1（左）和CHLA-20（右）神经母细胞瘤的GD2染色流式直方图；B. LAN-1（左）和CHLA-20（右）神经母细胞瘤中DB组与NAXI组的GD2 gMFI定量分析

　　04

　　DB vs NAXI与靶向非活性肿瘤细胞结合的特性

　　与未经死亡细胞预孵育的对照组相比，在整个浓度范围内（10 3~1 g/ml），与表达GD2的死亡肿瘤细胞孵育后，DB和NAXI的几何平均荧光强度（gMFI）均显著降低（图5A）。其中，NAXI的GD2结合能力对两种细胞系（LAN-1、CHLA-20）均降低达5倍，而DB降低约2倍（图5B）。由此可推测，与DB相比，由死亡肿瘤细胞介导的GD2依赖性抗体处置效应对NAXI的影响更大，这可能解释了前面观察到的ADCC反应差异（图2）。

　　图5 DB和NAXI与表达GD2的死亡肿瘤细胞孵育后GD2结合能力的丧失比较

　　注：A. DB（上）和NAXI（下）与表达GD2的死亡肿瘤细胞孵育后，与LAN-1（左）、CHLA-20（右）活细胞的GD2结合能力，以gMFI表示；B. DB和NAXI与表达GD2的死亡肿瘤细胞孵育后,与LAN-1（左）、CHLA-20（右）活细胞的GD2结合能力降低倍数,以荧光强度损失倍数表示

　　05

　　sGD2对DB/NAXI与神经母细胞瘤肿瘤细胞结合力的影响

　　在所有sGD2浓度下，sGD2对各浓度DB与神经母细胞瘤细胞结合没有显著不利影响（图6A）。而当NAXI与100 nM和1000 nM sGD2共孵育时，所有浓度的NAXI的结合能力均显著降低。使用10 nM sGD2时，观察到NAXI在浓度较低时结合能力显著降低（图6A）。

　　研究者通过将不存在sGD2时测定的gMFI除以存在sGD2时的强度，计算出sGD2存在下抗体与神经母细胞瘤细胞结合能力的降低倍数。结果显示，添加100 nM和1000 nM sGD2时，NAXI的结合能力降低倍数显著高于DB（图6B）。对于10 nM sGD2，NAXI结合能力的降低在0.001~0.1 μg/ml浓度范围内显著，而对DB结合无影响，表明即使是低sGD2水平也会影响NAXI的结合能力。

　　在10 nM sGD2（通常低于神经母细胞瘤患者观察到的浓度水平）存在下，两种抗体的结合曲线重叠（图6C）。然而，在100 nM和1000 nM sGD2存在下，与DB相比，NAXI在所有抗体浓度下与神经母细胞瘤细胞的结合能力均显著降低（图6C）。总的来说，这些数据表明，相较于DB，NAXI更易受到临床相关浓度下sGD2沉积效应的显著影响。可能的机制是，高亲和力抗体NAXI易被sGD2捕获，导致其与肿瘤细胞的结合效率显著降低，而中等亲和力抗体DB因结合价态差异（单价为主）更耐受sGD2干扰。

　　图6 sGD2对DB和NAXI结合能力的影响比较

　　注：A. DB（左）和 NAXI（右）在存在不同浓度sGD2时的结合能力（gMFI GD2），分别采用线性（上）和对数（下）的形式展示。B. 存在不同浓度sGD2的情况下，DB和NAXI与神经母细胞瘤细胞结合能力的降低倍数；C. DB和NAXI在存在10 nM（左）、100 nM（中）、1000 nM（右）sGD2时的结合能力的直接比较

　　06

　　DB vs NAXI在神经母细胞瘤细胞中的内化特性

　　与人IgG1同型对照组（利妥昔单抗）相比，NAXI和DB均在24小时内快速内化（图7A、B）。在0.1 μg/ml和1 μg/ml浓度下，NAXI被高GD2表达的LAN-1和CHLA-20神经母细胞瘤细胞内化的速率显著高于DB（图7C、D）。在低于0.1 μg/ml的浓度下，未检测到显著的内化水平（图7C、D）。由此可见，NAXI以比DB更高的速率和程度被内化到肿瘤细胞中。

　　图7 DB和NAXI在肿瘤细胞中的内化情况

　　注：A. 使用对pH敏感的pHrodo染料标记的DB和NAXI处理LAN-1和CHLA-20肿瘤细胞0、6、12小时后的图像；B. LAN-1（左）和CHLA-20（右）肿瘤细胞中抗GD2抗体内化随时间变化的定量图；C. pHrodo染料标记的DB和NAXI在LAN-1肿瘤细胞的随时间积累的橙色荧光强度比较；D. pHrodo染料标记的DB和NAXI在CHLA-20肿瘤细胞的随时间积累的橙色荧光强度比较

　　07

　　DB vs NAXI 受免疫细胞影响的内化作用

　　采用pH敏感的pHrodo标记NAXI和DB抗体（1 μg/ml），通过活细胞成像技术评估免疫细胞对抗体内化作用的影响，并通过流式细胞术进行验证分析。首先，基于标准前向/侧向散射和CD45门控来区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三大亚群，随后检测各亚群中CD64和GD2的表达水平，以分析抗体内化作用与这些受体表达的相关性。

　　活细胞成像显示，相较于DB，NAXI在直径较大的外周血单核细胞（12-15 μm）中被快速且更强地内化，差异具有统计学意义（图8A）。全血样本的流式细胞术分析显示，单核细胞和粒细胞部分表达CD64，但不表达GD2，而淋巴细胞均不表达CD64和GD2（图8C、D）。由此可见，淋巴细胞既不内化DB也不内化NAXI（图8E）。相比之下，单核细胞（NAXI vs DB：18%±3% vs 6%±1%，p=0.0166）和粒细胞（NAXI vs DB：9%±3% vs 1%±2%，p=0.0083）对NAXI的内化作用显著强于DB。以上数据显示，相较于DB，NAXI主要被CD64+单核细胞更强地内化。

　　图8 DB和NAXI在免疫细胞中的内化情况

　　注：A. 免疫细胞经pHrodo染料标记的DB和NAXI处理第0、6、12小时的图像，白细胞内化作用以红色荧光表示；B. NAXI、DB及无抗体对照组随时间变化的内化作用曲线；C. 基于标准前向/侧向散射和CD45门控进行白细胞亚群的识别情况，以及pHrodo染料标记的DB和NAXI在单核细胞内化和CD64染色的散点图；D. 淋巴细胞（左）、单核细胞（中）和粒细胞（右）的GD2（上）与CD64（下）表达水平；E. pHrodo染料标记的DB和NAXI以及无抗体对照组在淋巴细胞（左）、单核细胞（中）和粒细胞（右）中的内化比例

　　08

　　sGD2对DB和NAXI介导的ADCC的影响

　　CHLA-20神经母细胞瘤球体活力测定（168小时）结果显示，在添加100 nM和1000 nM sGD2时，相较于对照组，NAXI介导的ADCC效应显著降低，而sGD2对DB介导的ADCC没有显著影响（图9A）。直接比较显示，在100 nM和1000 nM sGD2存在的情况下，DB介导的ADCC显著强于NAXI介导的ADCC（图9B）。

　　图9 sGD2对DB和NAXI介导的ADCC的影响

　　注：A. NAXI、DB及PBMCs（介导ADCC效应）在0、100、1000 nM sGD2存在的条件下，肿瘤球体的存活率AUC的差异；B. DB与NAXI介导的ADCC效应在100 nM和1000 nM sGD2存在条件下的肿瘤球体存活率AUC比较

　　研究结论

　　在临床相关浓度范围内，DB较NAXI表现出更强的ADCC效应，这一差异主要与NAXI相较于DB具有更显著的TMDD效应有关。